Биология связи, том 5, Номер статьи: 987 (2022) Цитировать эту статью
2133 Доступа
11 Альтметрика
Подробности о метриках
Авторская поправка к этой статье была опубликована 10 октября 2022 г.
Эта статья обновлена
Альтернативный сплайсинг — это механизм процессинга РНК, участвующий в развитии и патологии скелетных мышц. При мышечных заболеваниях наблюдаются изменения сплайсинга и изменения в механобиологии, что побуждает нас исследовать взаимосвязь между механическими силами и процессингом РНК. Мы провели глубокое секвенирование РНК после растяжения мышечных клеток. Во-первых, мы обнаружили транскрипционные изменения в генах, кодирующих белки, участвующие в мышечной функции и транскрипции. Во-вторых, мы заметили, что многочисленные механочувствительные гены являются частью пути MAPK, который активируется в ответ на растяжение. В-третьих, мы обнаружили, что растяжение клеток скелетных мышц увеличивает долю альтернативно сплайсированных кассетных экзонов и их включение. В-четвертых, мы продемонстрировали, что белки, богатые серином и аргинином, демонстрируют более сильные транскрипционные изменения, чем другие РНК-связывающие белки, и что фосфорилирование SRSF4 является механочувствительным. Идентификация SRSF4 как механочувствительного РНК-связывающего белка, который может способствовать взаимодействию между механотрансдукцией, транскрипцией и сплайсингом, потенциально может открыть новое понимание мышечных заболеваний, особенно тех, которые имеют неизвестную этиологию.
Альтернативный сплайсинг — это механизм процессинга РНК, который расширяет разнообразие белков и чрезвычайно распространен у высших эукариот: более 95% генов человека подвергаются альтернативному сплайсингу1. В скелетных мышцах постнатально происходят обширные переходы альтернативного сплайсинга2, способствующие созреванию сократительного аппарата3,4,5,6. Скелетные мышцы представляют собой сложную ткань, развитие которой зависит как от молекулярных механизмов, так и от механических свойств. Сократительный аппарат мышц состоит из саркомеров, поперечных канальцев и костамеров, которые вместе передают силу как через мышечные клетки, так и от ядра к плазматической мембране в процессе, известном как механотрансдукция7. Интересно, что при различных мышечных заболеваниях альтернативные паттерны сплайсинга у взрослых возвращаются к эмбриональным стадиям, что приводит к потере мышечной массы, атрофии и функциональной недостаточности мышц3,4,8,9. Таким образом, молекулярные переходы в скелетных мышцах важны для правильного развития ткани.
Помимо молекулярных изменений во время развития, скелетные мышцы должны реагировать на механические силы и генерировать скоординированные всплески силы посредством сокращения. Мышечные клетки особенно чувствительны к механотрансдукции10; жесткость окружающей среды контролирует удлинение и дифференцировку клеток, что, в свою очередь, имеет решающее значение для эффективного сокращения мышц11. По сравнению со здоровыми людьми, мышечные клетки у людей, страдающих мышечной дистрофией, более жесткие, и считается, что это препятствует правильной сократимости, что в конечном итоге приводит к атрофии мышц11,12,13.
Было широко продемонстрировано, что глобальное неправильное сплайсинг или неправильная регуляция отдельных событий альтернативного сплайсинга приводит к потере правильной мышечной функции2,3,4,6,14,15. У мышей с мышечной дистрофией Дюшенна (которая нарушает регуляцию сплайсинга) наблюдаются изменения в механочувствительных сигнальных путях, что указывает на то, что физические изменения в мышцах связаны с молекулярными реакциями16. Развивая эту идею, стареющие мыши с мышечной дистрофией демонстрируют снижение утомляемости в ответ на вмешательство, которое включает как терапию с переключением сплайсов, так и физические упражнения17. Эти исследования устанавливают связь между мышечными заболеваниями, нарушением регуляции сплайсинга и механическими изменениями мышц. Однако неизвестно, как механические силы и альтернативный сплайсинг взаимодействуют для поддержания мышечного гомеостаза и в какой степени они способствуют возникновению мышечных заболеваний.
90% of them mapping to the mm10 mouse genome (Supplementary Data 1). The high mapping rate indicates appropriate quality of our sequencing data. We first confirmed that several myogenesis markers were not expressed in the myoblast samples and were highly induced in the differentiated cells (Supplementary Fig. 1). We next performed principal component analysis (PCA) to cluster samples based on gene expression for both myoblasts (Fig. 1a) and differentiated cells (Fig. 1b). The non-stretched myoblasts segregated together with two distinct subclusters for the 1 h stretched samples and the 6 h stretched samples (Fig. 1a, dark green and dark blue respectively). The 3 h stretched myoblasts segregated closer to the non-stretched samples (Fig. 1a, dark purple). In the differentiated cells, all the non-stretched samples segregated together and we observed three distinct groups for the different stretching time points demonstrating that varying times of stretching resulted in distinct gene expression changes (Fig. 1b, dark green, dark purple, and dark blue). One of the 1 h stretched samples did not segregate closely with the other replicates but remained more similar to them than to samples at other time points. This sample passed other quality controls and was therefore included with all samples in the analysis described in the results. Post hoc tests excluding this sample were performed and did not change the conclusions of the study./p>1.50 (upregulated, up) or fold change < −1.50 (downregulated, down). e, f. Correlation plot between the gene expression changes (expressed as log2foldchange) as measured by qPCR assays and those observed in the RNA-seq studies in myoblasts and differentiated cells. The qPCR graphs for the individual genes included in the correlation plots are shown in Supplementary Fig. 2 (myoblasts) and Supplementary Fig. 3 (differentiated cells)./p>1.5 for upregulated genes and a fold change <−1.5 for downregulated genes and an adjusted p-value < 0.05. Two of the genes assayed in both myoblasts and differentiated cells were the connective tissue growth factor (Ctgf) and the cysteine-rich angiogenic inducer 61 (Cyr61) which are both well-established mechanosensitive genes26,27,28. Ctgf and Cyr61 mRNAs were upregulated after 1 h of stretching in myoblasts and after 1 h and 3 h of stretching in differentiated cells indicating successful cellular stretching (Supplementary Figs. 2, 3). After 6 h of stretching, Ctgf and Cyr61 mRNAs were not upregulated in either myoblasts or differentiated cells (Supplementary Figs. 2, 3) suggesting that the cells become accustomed to the long mechanical stimulus which has been previously reported28./p> 10. In myoblasts, we observed an increase in the total number of splicing events as the cells were stretched for longer periods of time (Fig. 4a, left). Whereas in differentiated cells, the total number of splicing events increased from 1 h to 3 h and slightly decreased from 3 h to 6 h (Fig. 4a, right)./p> 10 between stretched and non-stretched samples. The ΔPSI was defined as the difference between the PSI in stretched samples and the PSI in the non-stretched controls. PSI percent spliced in./p>44% of splicing events at all time points were cassette exons (Fig. 5b). Second, we found that as cells were stretched, the proportion of cassette exons being alternatively spliced increased over time while the proportion of retained introns decreased (except for the transition from 3 h to 6 h in differentiated cells) (Fig. 5b). We focused the rest of our analysis on cassette exons since these were the most prevalent type of splicing event./p> 10, blue) or more exclusion (ΔPSI < −10, red) of the alternatively spliced region upon stretching. The numbers between parentheses indicate the number of splicing events. The ΔPSI was defined as the difference between the PSI in stretched samples and the PSI in the non-stretched controls. PSI percent spliced in./p> 10 (stretching induces inclusion) increases over stretching time (Supplementary Fig. 8a, left). In differentiated cells, we observed a more drastic trend in the same direction (Supplementary Fig. 8a, right). Since we focused most of our analysis on cassette exons we also determined if stretching induced more skipping or inclusion specifically of cassette exons. In myoblasts, the proportion of cassette exons with ΔPSI <−10 (stretching induces exclusion) increases slightly over stretching time (Fig. 5e, top). In differentiated cells, we observed an opposite trend with longer stretching times inducing more inclusion of cassette exons (Fig. 5e, bottom)./p> 95, r28S:18 S > 2.8 and RNA integrated number (RIN) > 8.4. Kapa mRNA stranded method was used for library preparation. All samples were pooled, and the library was first run on an Illumina MiSeq Nano to verify sequencing quality. After quality verification, the library was run on one flow cell over four lanes on a NovaSeq 6000S4 sequencer in a paired end 2 × 100 cycle run at the High Throughput Sequencing Core at The University of North Carolina at Chapel Hill./p>1.50 for upregulated genes, or fold change <−1.50 for downregulated genes). Significant changes in gene expression for myoblasts are in Supplementary Data 2 and for differentiated cells are in Supplementary Data 3. To determine differential alternative splicing in response to stretching, reads were aligned to the Gencode mm10 genome and Gencode vM20 transcriptome that contained reference chromosomes, scaffolds, assembly patches, and haplotypes. Differential splicing was determined using MISO and datasets were created that contained the MISO summary counts of all samples at each timepoint35. Those datasets were then used to compare the stretched samples to the non-stretched controls at each timepoint. Events were filtered by total read depth ≥15 and either inclusion reads ≥5 or exclusion reads ≥5. After filtering, events were considered alternatively spliced if |ΔPSI| (|PSIstretch–PSIno stretch|) >10 and the Wilcox p-value (stretch versus no stretch) ≤0.05. Significant changes in alternative splicing for myoblasts are in Supplementary Data 4 and those for differentiated cells are in Supplementary Data 5. In the excel files the ΔPSI values are shown in a scale from 0 to 1 (for inclusion) or 0 to −1 (for exclusion)./p>3.0.CO;2-C" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-0177%28199808%29212%3A4%3C495%3A%3AAID-AJA3%3E3.0.CO%3B2-C" aria-label="Article reference 47" data-doi="10.1002/(SICI)1097-0177(199808)212:43.0.CO;2-C"Article CAS PubMed Google Scholar /p>
Русский
English
Français
Deutsch
Español
Italiano
Português
日本語
한국어